是一种以高血糖、胰岛素抵抗和低度炎症为特征的慢性代谢性疾病，可导致脑血管疾病、糖尿病肾病等严重并发症。T2DM被认为是由饮食不当或不健康、缺乏运动、吸烟和肥胖引起的。随着经济的发展和我们正常的生活质量的提高，T2DM的发病率在全球范围内逐渐增加。根据国际糖尿病联合会2021年发布的数据，全球2型糖尿病患者已达5.37亿人，预计到2030年将增至6.43亿人。因此，加强T2DM研究体系建设，促进T2DM防控机制的建立，已成为科学研究的重要目标。
大量证据说明，肠道菌群失调与糖尿病的发生发展紧密关联。肠道菌群的结构变化可引起细菌动态失衡，增加革兰氏阴性菌的丰度，由此产生内毒素。此外，高水平的内毒素可与toll样受体4 (TLR4)结合，激活核因子κb (NF-κB)通路，释放破坏肠道屏障完整性的细胞因子，导致细菌内毒素渗漏到门静脉循环，引发全身慢性炎症反应，因此导致胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常。同时，肠屏障的不完整可启动肠粘膜内的致糖尿病胰岛反应性T细胞，促进自身免疫性糖尿病的发生。
粪便菌群移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)是指将健康供体粪便滤液植入受体肠道，重建肠道菌群，治疗肠道菌群失衡疾病。许多证据说明，FMT在治疗T2DM中起着及其重要的作用，因为FMT能恢复健康的肠道屏障，从而延缓糖尿病的发展。同时，也有报道表明，FMT能改善肠道菌群组成，保护肠道屏障。这些根据结果得出，FMT在修复肠道微生物群紊乱引起的肠道屏障损伤中起着重要作用。
食用菌因其丰富的营养和药用价值，慢慢的受到研究者的重视。蛹虫草在东亚国家作为传统药物和功能食品被普遍的使用了几个世纪。其中蛹虫草多糖的含量最为丰富，有报道称蛹虫草多糖具有多种生物活性，如降脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、降糖和抗炎等。我们之前的研究表明，蛹虫草的酸提取多糖(AEPS)能改善HFD和stz诱导的T2DM的症状。然而，对其抗糖尿病作用的机制尚未深入研究。已有研究证实，蛹虫草多糖在上消化道不被降解吸收，不易消化的多糖可能被肠道菌群分解而发挥作用。
饮食干预6周后，所有小鼠禁食不禁水12h。糖尿病组在72h内腹腔注射60 mg/kg柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L, pH 4.5) STZ溶液2次，NC组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。观察2周后，用血糖仪测定各组小鼠的空腹血糖(FBG)，FBG水平≥11.1 mmol/L的小鼠作为T2DM小鼠。然后，将所有T2DM小鼠随机分为两组，模型对照组(MC，n = 10)和AEPSa治疗组(n = 10)。AEPSa治疗组小鼠给予AEPSa 400 mg/kg/ d, NC组和MC组小鼠给予一样体积的PBS，每天灌胃1次，持续6周。试验期间，每周记录摄水量和摄食量，在8、9、11、13、14周分别测定5次空腹血糖。在治疗的最后一周，收集所有小鼠的粪便。整个实验持续14周。实验结束时，在戊巴比妥钠麻醉下处死小鼠。从眼眶采血，迅速切除结肠、肝脏、肾脏和胰腺。收集的样品用于进一步测试。
血清相关指标分析：取血清(2000 rpm, 10 min)，按照试剂盒说明检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、空腹血清胰岛素(FINS)、脂联素(ADP)、瘦素(LEP)、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)和脂多糖(LPS)。胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA- IR)按下式计算:
口服葡萄糖耐量试验(OGGT)：AEPSa 治疗6周后，进行OGTT。小鼠以2 g/kg葡萄糖溶液灌胃，并在0、30、60、90和120 min时测定血糖水平。
结肠炎性细胞因子分析：采用ELISA试剂盒检测结肠肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6。
组织病理学分析：固定结肠、肝、肾、胰腺5μm切片，修整、洗涤、脱水、清理、切片，脱蜡成水，苏木精和伊红染色，中性树脂贴装。最后，在显微镜下观察染色切片并拍照。
FMT对T2DM小鼠症状及肠道屏障的影响：FMT实验验证了肠道菌群与AEPSa 介导的调节之间的因果关系。NC组和AEPSa组小鼠在13周和14周收集粪便，保存于-80℃冰箱中，在无菌条件下低温溶解于无菌生理盐水(100 mg/1 mL)中，离心(1000 rpm, 1 min, 4℃)，得到粪便微生物富集液。
AEPS的纯化：收集一种中性多糖(AEPSa)，用DEAE-52色谱法用去离子水洗脱(图1A)。采用Sephadex G-100层析对AEPSa进行纯化，得到精制AEPSa。纯度测试表明，洗脱曲线B)，说明AEPSa为均相化合物。
同质性和MW检验：根据HPGPC曲线 min时出现了一个对称的宽峰，说明AEPSa为均相化合物，与纯化结果一致，其Mw为87.8 kDa。
单糖组成：HPLC图谱如图1E和F所示，与标准单糖的保留时间相比，AEPSa由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为2.2:15.1:1。
2、AEPSa调节HFD/ stz诱导的T2DM小鼠的饮水、食物摄入、葡萄糖代谢和激素：
4、AEPSa对HFD/stz诱导的T2DM小鼠肝、肾、胰腺损伤有改善作用：
如图3C、D所示，与NC组相比，MC组AST、ALT活性非常明显升高(P 0.05)，说明长期给药HDF/STZ引起肝损伤，而AST、ALT异常变化显著改善(P 0.05)。同时，肝脏组织病理学图像如图3G所示。NC组小鼠肝脏切片显示肝脏结构正常，肝细胞排列规则，而MC组表现为核萎缩，细胞边界模糊，肝细胞大量坏死，肝细胞肿胀，分散的水泡性脂肪变性和空泡变性。然而，口服AEPSa可显著改善这些异常变化。根据结果得出，AEPSa可减轻HDF/STZ所致肝损伤。
如图3E和F所示，与NC组相比，MC组BUN和Cr水平非常明显升高(P 0.05)，说明T2DM小鼠肾功能受损，而补充AEPSa可显著抑制BUN和Cr的升高。同时，肾脏组织病理学图如图3H所示。NC组小鼠肾切片显示肾小球及周围结构正常，而MC组肾损伤表现为肾小球肿胀、肾小球囊间隙变宽、肾小球边界不明。然而，AEPSa干预显著改善了这些异常变化。
这些结果验证了AEPSa对HDF/ stz所致的肾损伤具有一定的缓解作用。
胰腺的组织病理学图像如图3I所示。NC组胰岛结构正常，呈卵形细胞团，边界清晰，胰腺内各细胞排列规则，细胞核清晰。反之，严重的胰岛损伤表现为胰岛结构异常，边界不清，萎缩。经AEPSa干预后，病理改变均有不同程度缓解。
5、AEPSa对HFD/stz诱导的T2DM小鼠结肠肠道屏障具有保护作用：
F图4A-D显示，与NC组相比，MC组Claudin1、Occludin和ZO-1的表达水平显著下调(P 0.05)，仅为NC组的56.47%、59.36%和66.03%，说明T2DM小鼠肠道屏障受到损伤。然而，AEPSa明显上调了Claudin1、Occludin和ZO-1的表达，表明AEPSa在某些特定的程度上恢复了T2DM小鼠的肠道屏障。结肠的组织病理学图像如图4E所示。NC组小鼠结肠切片显示结肠上皮完整，隐窝结构排列有序，杯状细胞分布均匀，而MC组结肠损伤表现为明显的炎症浸润，杯状细胞减少，隐窝紊乱，隐窝分支萎缩。经AEPSa干预后，上述病理改变均有不同程度缓解。
黑色箭头代表炎症浸润，红色箭头代表杯状细胞，圆圈部分代表隐窝，黑色宽箭头代表萎缩的隐窝
与NC组比较，MC组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4蛋白表达水平及NF-κBp65、i -κBα磷酸化水平均非常明显升高(P0.05)，说明TLR4/NF- κB通路被激活，T2DM小鼠结肠组织发生炎症反应，与结肠组织病理变化相似。然而，AEPSa干预后，TNF-α、IL-1β、IL-6和TLR4蛋白表达的变化以及NF-κB p65和i-κB α的磷酸化被明显逆转。上述结果提示AEPSa可抑制TLR4/NF-κB通路，缓解结肠炎症的发展，结肠组织病理学观察证实了这一结论。
主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)显示，NC组和MC组肠道菌群组成的聚类结果明显不同(图6C和D)。添加AEPSa后，MC组和AEPSa组肠道菌群组成的聚类结果明显分离(图S6)。OTU层次聚类树的结果与PCA和PCoA相似。β多样性分析表明，AEPSa可调节T2DM小鼠肠道菌群。
在门水平上，评估了多组之间的差异(图6H-J)。拟杆菌门, 弯曲杆菌和脱铁杆菌群之间的差异最显著NC、MC和AEPSa组(P0.05)。与NC组相比拟杆菌、弯曲杆菌和大肠杆菌的相对丰度细菌显著减少(P0.05)。然而，AEPSa支持的相对丰度显著增加拟杆菌门和弯曲菌门(P0.05)。这些根据结果得出在门水平上，肠道菌群显著改善到不同程度的AEPSa补充。
HFD/ stz诱导T2DM小鼠肠道菌群组成及属水平差异：在属水平上的Circos图和相对丰度表显示:未分类的拟杆菌门S24-7菌科、乳酸菌、毛螺菌属NK4A136属、unclassified_f_Lachnospiraceae、嗜黏蛋白阿克曼菌、短链脂肪酸产生菌、埃希氏杆菌、脱硫弧菌、革兰氏阳性菌、拟杆菌和幽门螺杆菌占优势。属水平的热图聚类分析显示，NC组与MC组的聚类结果有显著差异，而AEPSa干预后，AEPSa组的聚类结果与NC组相似，但比例不同(图7A)。
为了进一步分析属水平上微生物群落的变化，评估了两组瘤胃梭菌之间的差异(图7C和D)。与NC组相比，MC组的未分类的拟杆菌门S24-7菌科、短链脂肪酸产生菌、幽门螺杆菌、毛螺菌属NK4A136组和瘤胃梭菌的相对丰度明显降低(P0.05)，MC组中 肠球菌、瘤胃球菌组和真/优杆菌属非常明显升高(P0.05)。经AEPSa处理后，未分类的拟杆菌门S24-7菌科、毛螺菌属NK4A136属、诺维氏梭菌、另枝菌属、幽门螺杆菌和厚壁菌门毛螺菌的相对丰度升高(P0.05)， 大肠杆菌志贺菌和肠球菌的相对丰度降低(P 0.05)。此外，利用LEfSe分析了组间不同的分类群(图7E和F)。MC组在属水平上的瘤胃球菌和肠球菌较NC组显著增加，而在属水平上，AEPSa组的未分类的拟杆菌门S24-7菌科、毛螺菌属NK4A136属和厚壁菌门毛螺菌较MC组非常明显升高。这些结果共同证实了AEPSa干预能改善T2DM小鼠肠道菌群共生的损害。
HFD/ stz诱导T2DM小鼠肠道菌群与LPS/TLR4/NF-κB通路的关系：图7G显示了属水平上LPS/ TLR4/NF-κB通路与肠道微生物群的Spearman相关分析热图。肠球菌和瘤胃球菌与TNF-α、p-p65、LPS、IL-6、p-Iκbα、TLR4和IL-1β呈显著正相关，幽门螺杆菌、未分类的拟杆菌门S24-7菌科、短链脂肪酸产生菌、厚壁菌门毛螺菌和颤螺旋菌科与TNF-α、p-p65、LPS、IL-6、p- IκBα、TLR4和IL-1β呈显著负相关。因此，LPS/TLR4/NF-κB通路与肠道微生物群的关键种型之间有关键相关性。
为了进一步分析肠道菌群与AEPSa介导的调节之间的因果关系，在HDF/ stz诱导的T2DM小鼠中通过流程图(图8A)进行FMT。
与MC组相比，FMT-NC组和FMT-AEPSa组血清中饮水量、摄食量、FBG水平、OGTT AUC、FINS水平、HOMA-IR、TC含量、TG含量、AST活性、ALT活性、BUN水平、Cr水平和LPS水平均明显降低(P 0.05，图8B-M)。同时，FMT-NC和FMT-AEPSa组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6、P-IκBα/IκBα、P-p65/p65、TLR4水平较MC组明显降低，claudin、Occludin、ZO-1蛋白水平较MC组升高(P0.05，图80 - s)。此外，FMT- nc组和FMT- AEPSa组胰腺和结肠的组织病理学异常变化均不同程度地得到一定的改善。这些结果证明FMT能改善HDF/stz诱导的T2DM小鼠的血脂和糖代谢、肠道屏障、TLR4/NF-κB通路以及肝、肾、结肠和胰腺的损伤，也进一步表明AEPSa处理的T2DM小鼠供体肠道微生物群在这一过程中发挥了重要作用。
本文研究了AEPSa的降糖能力及其潜在机制。根据结果得出，AEPSa对T2DM小鼠有着非常明显的降血糖作用，其机制可能是通过增加短链脂肪酸产生菌、另枝菌属、毛螺旋菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group）和未分类的拟杆菌门S24-7菌科（norank_f_Muribaculaceae），降低肠球菌和瘤胃球菌对TLR4/NF-κB通路的保护作用来改善高血糖(图9)。进一步表明AEPSa可能通过调节肠道微生物群而成为治疗2型糖尿病的良好选择。
然而，在AEPSa用于预防和治疗T2DM之前，还需要更加多的工作来评估其剂量效应和构效关系。
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