酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay)，简称 ELISA，是用于检测体液中微量物质的固相免疫测定方法。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。最初是在1971年由瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs报道的一项新成果。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 。
通过抗原与抗体的特异性免疫反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗原也可以是抗体。
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化水解或氧化还原反应而成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
所生成有色产物的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。
ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 在这种测定方法中有三个必要的试剂：
根据试剂的来源和标本的情况及检测具体条件， 可设计出各种不一样的检测的新方法。 用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型：
2)加入待测标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBeAg、HBsAg、hCG 、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标所使用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具备极高的特异性，还能够将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，此现状被为钩状效应(hook effect)，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等)时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗体。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法重点是酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
1、将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2、加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3、加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig 以检测总抗体，但一般多用酶标抗人 IgG 检测IgG 抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4、加底物显色本法大多数都用在对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的重点是抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以i为工程酶的重组抗原，如其中含有 E.Coli 成份，很可能与受过 E.Coli 感染者血崩中的抗E.Coli 抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人 Ig 反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的 Ig 去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗 HBc的检测一般都会采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗 HBe 的检测一般都会采用此法。
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，能够使用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA 测定多用此法。
IgM 抗体的检测用于传染病的早期诊断中。 间接法 ELISA 一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的 IgG 抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份 IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人 IgM 作为二抗， 间接测定 IgM 抗体， 必须先将标本用 A 蛋白或抗 IgG抗体处理， 以除去 IgG 的干扰。在临床检验中测定抗体 IgM 时多采用捕获包被法。先用抗人 IgM 抗体包被固相，以捕获血清标本中的 IgM(这中间还包括针对抗原的特异性 IgM 抗体和非特异性的 IgM)。然后加入抗原，此抗原仅与特异性 IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的 IgM 成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒(HAV)抗体的检测模式。类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定 IgM 抗体，导致假阳
性反应。因此中和 IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗 CMV IgGM 和抗弓形虫 IgM抗体已获成功。
常用的亲和素为ABS。ABS 是亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量 60000，每个分子由 4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制作而成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与 4个生物素分子结合，因此如把 ABS 与 ELISA 法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原 ELISA 系统中的酶标抗体(抗原)。在 LAB 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提升敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于 ELISA 中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在 ELISA 应用中有替代前者的趋势。由于 ABS-ELISA 较普通ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中 ABS-ELISA 应用不多。此缺点，在 ELISA 应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA 较普通ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中 ABS-ELISA 应用不多。
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。
其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。
1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10μg /孔，每孔加200μl，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200μl。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200μl, 放置37℃ 1小时。
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式 ELISA 各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球 ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在 ELISA 中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避开溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加深。一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用 pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
在 ELISA 中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法 ELISA)需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡 1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育， 在 ELISA中似不恰当。ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才可以做到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是怎么回事 ELISA反应总是需要一段时间的温育。
温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和 4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在 37℃经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在 43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应 4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在 ELISA 中一般不予采用。
保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将 ELISA 板置于水浴箱中，ELISA 板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将 ELISA 板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指 20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的格外的重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：
a.吸干或甩干孔内反应液;b.用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去);c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短;d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;e.重复操作c和d，洗涤 3-4 次(或按说明规定)。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于 0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗 2 分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡 2 分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。
显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一段时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严控，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。
OPD底物显色一般在室外温或 37℃反应 20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。
TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约 40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至 2 小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠 (SDS) 等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间 (12-24 小时)不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准 96 孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔)，以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，接着进行计算。
比色结果的表达以往通用光密度(oplical density，OD)，现按规定用吸光度(absorbence，A)，两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于 A 字母的右下角，如 OPD 的吸收波长为 492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。
酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到 0.001，准确性为±1%，重复性达 0.5%。举例说，若某孔测得的 A 值为 1.083，则该孔相对于空气的线)，重复测定数次，其 A 值均应 1.083±0.05(1.078~1.088)在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在 0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达 2.900，甚至更高。超出可测上限的 A 值常以*或over或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为 0.000~2.900，而其线，这在定量 ELISA 中制作标准曲线时应予注意。
酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 15~30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。
测读 A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如 OPD 用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长(W1)，第二次在不敏感波长(W2)，两次测定间不移动 ELISA板的位置。例如 OPD 用492nm为 W1，630nm为 W2，最终测得的 A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能不一样，使用中应详细新闻记者说明书。
定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出有或无的简单回答，分别用阳性、阴性表示。阳性表示该标本在该测定系统中有反应。阴性则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后做试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，能判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。
这类反应的定性结果能用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物(见 3.6)。在用肉眼判定结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。
目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样做才能够得到客观的数据。先读出标本(sample，S)、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值，接着进行计算。计算方式有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。
阳性判定值(cut-off value)一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判定结果阳性或阴性的标准。
用此法判定结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml。每次试验设 2个阳性对照和 3 个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX)，两个平均数的差(P-N)必须大于一个特定的数值(例 0.400)，试验才有效。3 个阴性对照A值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX;如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：
标本A值阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中 0.05 为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。
根据以上叙述能够准确的看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生试验无效的后果。
在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本(S)和阴性对照(N)的A值后，计算S/N值。也有写作P/N的，这里的P不代表阳性(positive)，而是病人 (patient) 的缩写，不应误解。为避免混淆， 更宜用S/N表示。 在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N0.05(或其他数值)，则按 0.05 计算，否则将出现假阳性结果。
在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在 1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。竞争法ELISA不易用自视判定结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方式主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为 125±100u/ml。每次试验设 2 个阳性对照和 3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX)，两个平均数的差(N-P)必须大于一个特定的数值(例如 0.300)，试验才有效。3 个阴性对照A值均应小于 2.000，而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另 2 个阴性对照重新计算×NCX;如有 2 个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：
ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法 ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近 2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈 S 形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。（来源北京大学第一医院）
